Фіксатор-барвник по Май-Грюнвальду в розчині, далі за текстом - фіксатор-барвник, призначений для застосування як фіксатор і барвник формених елементів крові.

Склад:

Фіксатор-барвник є 0,30% розчин сухого барвника еозин метиленовий синій по Май-Грюнвальду в метанолі.

Підготовка до аналізу

Приготування нейтралізованої води

Зважити на аналітичних терезах з точністю ± 0,01 г 9,50 г натрію фосфорнокислого двозаміщеного безводного або 22,70 г натрію фосфорнокислого двозаміщеного 12-водного; навішування перенести в мірний циліндр місткістю 1000 мл, додати 900 мл дистильованої води, перемішати до розчинення, довести до 1000 мл дистильованою водою і ретельно перемішати (розчин 1).

Зважити на аналітичних терезах з точністю ± 0,01 г 9,07 г калію фосфорнокислого однозаміщеного; навішування внести в мірний циліндр місткістю 1000 мл, додати 900 мл дистильованої води, перемішати до розчинення, довести до 1000 мл дистильованою водою і ретельно перемішати (розчин 2).

Внести в мірний циліндр місткістю 1000 мл 63 мл розчину 1 і 37 мл розчину 2 довести до 1000 мл дистильованою водою і визначити рН отриманої нейтралізованої води на рН-метрі; рН повинен бути в діапазоні 6,8 - 7,2.

Отриману нейтралізовану воду можна зберігати за кімнатної температури (+18 - 25°С).

Приготування мазків крові

Мазки крові зробити на предметних стеклах за допомогою вужчого предметного шліфованого скла наступним чином.

Взяти предметне скло за довгі краї і доторкнутися його поверхнею, відступивши на 0,5 - 1 см від вузького краю, краплі крові (але не до шкіри). Предметне скло слід тримати на столі або у лівій руці за краї. Правою рукою приставити шліфоване скло вузьким краєм до предметного скла з кров'ю ліворуч від краплі під кутом 45 ° і просунути його вправо до зіткнення з краплею крові. Чекати до тих пір, поки кров розпливеться по всьому ребру шліфованого скла, а потім легким швидким рухом провести його праворуч наліво доти, доки не буде вичерпана вся крапля. Крапля крові повинна бути невеликою і пропорційною так, щоб весь мазок поміщався на предметному склі, не доходячи 1 - 1,5 см до його краю. Сильно натискати на скло не можна, оскільки багато клітин крові можуть виявитися пошкодженими. Добре зроблений мазок тонкий, має жовтуватий колір і закінчується "метелонькою".

Після виготовлення мазки слід швидко висушити на повітрі до зникнення вологого блиску; при повільному висиханні може змінюватись морфологія клітин. Укласти препарати мазками догори на скляний місток для фарбування.

Проведення визначення

1 спосіб

Безпосередньо перед визначенням приготувати робочий розчин азур-еозин барвника по Романовському: змішати розчин барвника з нейтралізованою водою у співвідношенні 1:10 - 1:20 і профільтрувати. Отриманий розчин барвника можна зберігати протягом 6 годин.

На нефіксовані мазки крові налити нерозведений розчин фіксатора-барвника так, щоб він накрив весь мазок. Через 3 хв. змити фіксатор-барвник нейтралізованою водою і далі фарбувати робочим розчином азур-еозин барвника по Романовському протягом 15 - 45 хв. Після цього препарати промити нейтралізованою водою, висушити на повітрі і мікроскопувати.

2 спосіб

Безпосередньо перед визначенням розбавити фіксатор-барвник нейтралізованою водою у співвідношенні 1:2 – 1:5. Отриманий розчин розчинника фіксатора-барвника можна зберігати протягом 6 годин.

На нефіксовані мазки крові налити нерозведений розчин фіксатора-барвника так, щоб він накрив весь мазок. Через 3 хв. змити фіксатор-барвник нейтралізованою водою і далі фарбувати розведеним розчином фіксатора-барвника протягом 5-15 хв. Після цього препарати промити нейтралізованою водою, висушити на повітрі і мікроскопувати.

Забарвлення формених елементів крові має бути наступним:

Еритроцити - рожеві, рожеві з сірим або бежевим відтінком, бежево-коричневі;
Тромбоцити-рожево-фіолетові або фіолетові;
ЯДРА ЛІМФОЦИТІВ, МОНОЦИТІВ І НЕЙТРОФІЛІВ - фіолетові;
Цитоплазму лімфоцитів - блакитна, сіро-блакитна або синьо-блакитна;
ЦИТОПЛАЗМА МОНОЦИТІВ-сіро-блакитна;
ЦИТОПЛАЗМА НЕЙТРОФІЛІВ - блідо-рожева або рожево-сіра;
ЗЕРНІСТЬ НЕЙТРОФІЛІВ - фіолетова або червоно-фіолетова;
ЗЕРНІСТЬ ЕОЗИНОФІЛІВ - оранжево-червона, рожево-червона або рожево-фіолетова;
ЗЕРНІСТІСТЬ БАЗОФІЛІВ - фіолетова.

Примітки:

Замість фіксатора Май – Грюнвальда можна використовувати фіксатори Лейшмана та Йеннера. Вони відрізняються тільки за способом приготування, а результат забарвлення той самий.
Можна зробити робочий розчин фосфатному буфері з рН 6.8-7.0. Результати будуть стабільними.
Кількості розчинів азура та еозину в робочому розчині потребують коригування, це стає зрозумілим після перегляду перших зрізів. Особливо це необхідно при використанні несертифікованих барвників (без C.I. та сертифіката BSC).
Замість робочого розчину азура та еозину можна користуватися комерційним розчином фарби Романовського. Перед використанням у рутині відтестувати розведення, рН та час фарбування.
При появі дрібних синіх пластівців азура в розчині він не придатний для фарбування. Зробити свіжий розчин. Посуд для всіх барвників у цитології має бути бездоганно чистим. Після відмивання опадів старих розчинів посуд промивається дистильованою водою та висушується насухо. У ній не повинно бути жодних залишків миючих засобів.
Одного разу приготований робочий розчин придатний протягом 1 або 2 робочих днів, незалежно від кількості партій, що проходять протягом дня.
Дистильована вода для промивання повинна мати рН не нижче 6. При зберіганні дистильована вода закислюється. Якщо є можливість для промивання використовувати фосфатний буфер з рН 6.8-7.0. Або будь-який інший буфер з аналогічною рН.