Набір призначений для диференціального забарвлення, дослідження структури клітинної стінки і виявлення приналежності бактерій до грам-позитивних або до грам-негативних груп в клініко-діагностичних лабораторіях і науково- дослідницькій практиці.
- Набір розрахований на проведення 1000 аналізів (при витраті кожного з робочих розчинів реагентів 50 мкл на визначення).
- Зберігання набору - при температурі від плюс 2 °С до плюс 25 °С.
- Гарантійний термін придатності набору - 12 місяців від дня виготовлення.
- Зберігати в захищеному від світла місці!
- Набір призначено для застосування in vitro тільки кваліфікованим лабораторним персоналом.
ПРИНЦИП МЕТОДУ
Забарвлення за Грамом застосовується для забарвлення бактерій в мазках з культур,
ексудатів, тканин і та інших. Принцип методу заснований на різниці в хімічному складі клітинної
стінки прокаріотичних мікроорганізмів. Сутність методу полягає в тому, що при слаболужній
реакції бактерії забарвлюються основними барвниками трифенілметанової групи (кристалвіолет,
генціанвіолет, метилвіолет). Обробка йодом призводить до міцної фіксації барвника в грам
позитивних бактеріях. Подальше промивання забарвленого препарату нейтральним спиртом або
ацетоном не знебарвлює грам - позитивні бактерії. У грам - негативних бактеріях під впливом йоду
не утворюється міцного комплексу, і обробка ацетоном або спиртом призводить до їх
знебварвлення. Грам - негативні бактерії діагностуються шляхом дофарбовування контрастним
барвником.
Кристалвіолет забарвлює бактерії в синьо-фіолетовий колір. Розчин Люголя реагує з
кристалвіолетом, формуючи комплекс кристалвіолет - йодид. Знебарвлюючий агент усуває синій
колір у грам - негативних бактерій, які забарвлюються в рожевий колір після забарвлення
сафраніном.
СКЛАД НАБОРУ
- Карболовий розчин генціану фіолетового - 1 флакон з (10,0 ± 0,5) мл.
- Розчин Люголя - 1 флакон з (50 ± 2) мл.
- Розчин сафраніну - 1 флакон з (50 ± 2) мл.
- Додатково потрібний реактив Імерсійна олія для мікроскопії (REF НР060.01 або REF НР060.02). До складу набору не входить!
АНАЛІЗУЄМИЙ МАТЕРІАЛ
Рідини, секрети з нижніх дихальних шляхів і тканинні секрети, спинномозкова рідина. Не використовувати зразки, забрудненні нормальною бактерійною флорою.
ОБЛАДНАННЯ
- Раковина або спеціальний місткий лоток для фарбування.
- Спеціальний штатив («рейки») для фарбування мазків на предметних стеклах.
- Пінцет або щипці для взяття предметних стекол.
- Газовий або спиртовий пальник.
- Фільтрувальний папір розміром < 4 х 1,5 см для фарбування мазків.
- Дистильована вода для промивання мазків.
- Штатив для просушування забарвлених стекол на повітрі у вертикальному або нахиленому положенні.
ПРИГОТУВАННЯ РОБОЧИХ РОЗЧИНІВ
-
Робочий розчин генціану фіолетового одержують додаванням до вмісту флакона з Карболовим розчином генциану фіолетового 40 мл дистильованої води кімнатної температури. Енергійно струшують флакон протягом 30 с. Витримують протягом 1 години. Розчин стійкий при зберіганні протягом 2-х місяців при температурі від плюс 15 °С до плюс 25 °С.
-
Розчин Люголя готовий до використання. Придатний для роботи до закінчення терміну, зазначеного на упаковці, за умови зберігання при температурі від плюс 2 °С до плюс 25 °С.
-
Розчин сафраніну готовий до використання. Придатний для роботи до закінчення терміну, зазначеного на упаковці, за умови зберігання при температурі від плюс 2 °С до плюс 25 °С.
ПРОВЕДЕННЯ АНАЛИЗУ
Предметне скло перед дослідженням знежирюють і роблять на ньому мазок досліджуваних культур. Мазок слід робити тонким, щоб клітини рівномірно розподілялися на поверхні скла і не утворювали скупчень. Препарат висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника (спиртовки) або метанолом і виконують наступні дії:
- на мазок кладуть смужку фільтрувального паперу;
- наносять 2 - 3 краплі з крапельниці (50 – 75 мкл) робочого розчину генціану фіолетового;
- витримують протягом 2 хв;
- видаляють фільтрувальний папір;
- не промиваючи препарат водою, наносять 2-3 краплі з крапельниці (50 - 75 мкл) розчину Люголя;
- витримують протягом 1-2 хв до почорніння препарату;
- зливають залишки фарбника і розчину Люголя;
- знебарвлюють протягом 30-45 сек 96° етиловим спиртом (Предметне скло для знебарвлення мазка занурюють кілька разів в склянку із спиртом, процес знебарвлення вважається завершеним, коли від мазка перестають відділятися забарвлені у фіолетовий колір цівки рідини.)
- ретельно промивають дистильованою водою;
- наносять 2-3 краплі з крапельниці (50-75 мкл) Розчину сафраніну (забарвлювач);
- витримують протягом 2 хв;
- зливають забарвлювач;
- промивають препарат дистильованою водою;
- висушують на повітрі;
- мікроскопують з імерсійною системою.
ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
При правильному фарбуванні грам-позитивні бактерії мають синьо-фіолетовий колір, а грам негативні - рожево-червоний.
ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК
Забруднення проби нормальною мікробною флорою, кров'ю або фарбувальними речовинами можуть порушити фарбування.
ЗАСТЕРЕЖНІ ЗАХОДИ
- При роботі використовувати гумові рукавички, заборонено їсти, пити, курити.
- Генціан фіолетовий - можливий канцероген. Небезпечний для водних організмів, може викликати довгострокові негативні ефекти у водному середовищі. Потрібно застосування спеціального захисного одягу і рукавичок. Необхідно уникати попадання мікроорганізмів в оточуюче середовище. Треба ретельно дотримуватися спеціальних інструкцій та техніки безпеки.
- Розчин Люголя: не вдихати пари розчину Люголя.