Набор предназначен для дифференциальной окраски, исследования структуры клеточной стенки и выявления принадлежности бактерий к грамположительным или грамотрицательным группам в клинико-диагностических лабораториях и научно-исследовательской практике.
- Набор рассчитан на проведение 1000 анализов (при расходе каждого из рабочих растворов реагентов 50 мкл на определение).
- Хранение набора - при температуре от плюс 2 °С до плюс 25 °С.
- Гарантийный срок годности набора - 12 месяцев со дня изготовления.
- Хранить в защищенном от света месте!
- Набор предназначен для применения in vitro только квалифицированным лабораторным персоналом.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Окраска по Граму применяется для окрашивания бактерий в мазках из культур,
экссудатов, тканей и других. Принцип метода основан на разнице в химическом составе клеточной
стенки прокариотических микроорганизмов. Сущность метода заключается в том, что при слабощелочной реакции бактерии окрашиваются основными красителями трифенилметановой группы (кристалвиолет, генцианвиолет, метилвиолет). Обработка йодом приводит к прочной фиксации красителя в грам положительных бактериях. Дальнейшее промывание окрашенного препарата нейтральным спиртом или ацетоном не обесцвечивает грамположительные бактерии. В грамотрицательных бактериях под воздействием йода не образуется прочный комплекс, и обработка ацетоном или спиртом приводит к их обесцвечиванию. Грам-отрицательные бактерии диагностируются путем доокрашивания контрастным красителем.
Кристалвиолет окрашивает бактерии в сине-фиолетовый цвет. Раствор Люголя реагирует с
кристалловиолетом, формируя комплекс кристалловиолет - йодид. Обесцвечивающий агент устраняет синий цвет у грам-отрицательных бактерий, которые окрашиваются в розовый цвет после окрашивания сафранином.
СОСТАВ НАБОРА
- Карболовый раствор генциана фиолетового - 1 флакон с (10,0 ± 0,5) мл.
- Раствор Люголя - 1 флакон с (50 ± 2) мл.
- Раствор сафранина - 1 флакон с (50 ± 2) мл.
- Дополнительно необходим реактив Иммерсионное масло для микроскопии (REF НР060.01 или REF НР060.02). В состав набора не входит!
АНАЛИЗИРУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
Жидкости, секреты из нижних дыхательных путей и тканевые секреты, спинномозговая жидкость. Не использовать образцы, загрязненные нормальной бактериальной флорой.
ОБОРУДОВАНИЕ
- Раковина или специальный вместительный лоток для окрашивания.
- Специальный штатив («рейки») для окрашивания мазков на предметных стеклах.
- Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол.
- Газовая или спиртовая горелка.
- Фильтровальная бумага размером < 4 х 1,5 см для окрашивания мазков.
- Дистиллированная вода для промывки мазков.
- Штатив для просушки окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ
-
Рабочий раствор генциана фиолетового получают добавлением к содержимому флакона с карболовым раствором генциана фиолетового 40 мл дистиллированной воды комнатной температуры. Энергично встряхивают флакон в течение 30 с. Выдерживают в течение 1 часа. Раствор устойчив при хранении в течение 2-х месяцев при температуре от плюс 15 °С до плюс 25 °С.
-
Раствор Люголя готов к использованию. Пригоден для работы до истечения срока, указанного на упаковке, при условии хранения при температуре от плюс 2 °С до плюс 25 °С.
-
Раствор сафранина готов к использованию. Пригоден для работы до истечения срока, указанного на упаковке, при условии хранения при температуре от плюс 2 °С до плюс 25 °С.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Предметные стекла перед исследованием обезжиривают и делают на них мазок исследуемых культур. Мазок следует делать тонким, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки (спиртовки) или метанолом и выполняют следующие действия:
- на мазок кладут полоску фильтровальной бумаги;
- наносят 2 - 3 капли из капельницы (50 - 75 мкл) рабочего раствора генциана фиолетового;
- выдерживают в течение 2 мин;
- удаляют фильтровальную бумагу;
- не промывая препарат водой, наносят 2-3 капли из капельницы (50 - 75 мкл) раствора Люголя;
- выдерживают в течение 1-2 мин до почернения препарата;
- сливают остатки красителя и раствора Люголя;
- обесцвечивают в течение 30-45 сек 96° этиловым спиртом (Предметные стекла для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стакан со спиртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.)
- тщательно промывают дистиллированной водой;
- наносят 2-3 капли из капельницы (50-75 мкл) раствора сафранина (краситель);
- выдерживают в течение 2 мин;
- сливают краситель;
- промывают препарат дистиллированной водой;
- высушивают на воздухе;
- микроскопируют с иммерсионной системой.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — розово-красный.
ИСТОЧНИКИ ОШИБОК
Загрязнение пробы нормальной микробной флорой, кровью или красящими веществами может нарушить окрашивание.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
- При работе использовать резиновые перчатки, запрещено есть, пить, курить.
- Генциан фиолетовый - возможный канцероген. Опасен для водных организмов, может вызвать долгосрочные негативные эффекты в водной среде. Требуется применение специальной защитной одежды и перчаток. Необходимо избегать попадания микроорганизмов в окружающую среду. Необходимо тщательно соблюдать специальные инструкции и технику безопасности.
- Раствор Люголя: не вдыхать пары раствора Люголя.