Набор применяется для определения активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови и плазме человека кинетическим методом в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике.
- Диапазон определяемых активностей - от 4 МЕд/л до 700 МЕд/л.
- Линейность метода должна сохраняться до скорости изменения оптической плотности (ΔЕ/мин) 0,16 для волн Hg 334 нм, 340 нм или 0,08 для Hg 365 нм
- Коэффициент вариации определения - не более 5 %
- Чувствительность 7 на 0,001 ед. оптической плотности за 1 мин – не более 3,5 МОд/л (365 нм).
- Хранение набора - при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С.
- Гарантийный срок годности набора - 12 месяцев со дня изготовления.
- Набор предназначен для применения in vitro только квалифицированным лабораторным персоналом.
ПРИНЦИП МЕТОДА
АсАТ катализирует перенос аминогруппы от L-аспартата к α-оксоглутарату, в результате чего образуются оксалацетат и L-глутамат. Полученный оксалацетат во время сопряженной реакции, катализируемой малат-дегидрогеназой (MDН), вступает в реакцию с NADH в присутствии ионов водорода. Продуктами этой реакции являются L-малат и NAD+.
Превращение NADH в NAD+ сопровождается изменением в спектре поглощения на длине волны 340 или 334 или 365 нм, при этом уменьшение оптической плотности (ОП) раствора прямо пропорционально активности АсАТ в исследоваемой пробе. В состав реагента входит также лактат-дегидрогеназа (LDH), необходимая для предотвращения влияния пирувата, который обычно содержится в небольших количествах в пробах, на результат анализа.
СОСТАВ НАБОРА
- Буферно-субстратный раствор АсАТ
- ТРИС буфер (80,0 ± 4,0) ммоль/л,
- L- аспарагиновая кислота (0,240 ± 0,012) моль/л,
- Коэнзим-энзимный реагент
- 2-оксоглутаровая кислота (12,0 ± 0,6) ммоль/л
- NADH (0,180 ± 0,009) ммоль/л
- лактатдегидрогеназа (LDH) 800 МОд/л
- малатдегидрогеназа (MDН) 600 МОд/л
ОБОРУДОВАНИЕ
-
Фотометрическое оборудование, способное измерять оптическую плотность растворов при длине волны 334, 340 или 365 нм в диапазоне (0-1,0) ед. опт. плотности и длине оптического пути 10 мм. (Возможно использование автоматического анализатора. Инструкция для автоматического анализатора высылается по заказу потребителя.)
-
Водяной термостат или автоматическая водяная баня, способные поддерживать температуру плюс (37 ± 0,5)°С.
-
Пипетки емкостью 1, 0,1 и 5 мл (ДСТУ EN ISO 835:2018).
ОБРАЗЕЦ
Сыворотка. Материал стабилен в течение 3 суток при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С. При хранении сыворотки при комнатной температуре активность ферментов снижается. Активность фермента в сыворотке снижается после 3 суток хранения при температуре от плюс 18 °С до плюс 25 °С - на 10%. ИЗБЕГАТЬ ГЕМОЛИЗА!
Плазма. Гепаринизированная или ЭДТО-плазма.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ
Рабочий раствор: согрейте до комнатной температуры и смешайте необходимые количества буферно-субстратного раствора АсАТ и коэнзим-энзимного реагента в соотношении 4:1 не менее чем за 20 минут до проведения анализа в темном стеклянном флаконе. Тщательно закрывайте флаконы непосредственно после каждого использования реактивов. Растворы светочувствительны. Не замораживать. Рабочий раствор устойчив не менее 4 недель при температуре хранения от плюс 2 °С до плюс 8 °С, 72 часа - от плюс 20 °С до плюс 25°С. Минимальная экстинция рабочего раствора против воды при 340 нм - 1,6 ед. опт. плотности.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Расход реактивов можно масштабировать в соответствии с аспирационным объемом кюветы анализатора, исходя из постоянного соотношения: Рабочий раствор : Анализируемый раствор = 10 : 1 (например, 1 мл Рабочего раствора + 0,1 мл сыворотки). Выдержите Рабочий раствор до выбранной температуры проведения анализа 3 мин (для 1 мл, если больше, то 5 мин) в кювете. Введите анализируемый материал в Рабочий раствор, тщательно перемешайте и через 1 мин считывайте экстинцию (Е1) по отношению к воздуху. Затем считывайте экстинцию (Е2) еще через 3 мин по отношению к воздуху. Рассчитайте среднее изменение экстинции за 1 мин. (∆Е/мин)
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля хода реакции и процедуры измерения рекомендуется использовать контрольные сыворотки со значениями, определенными данным методом. Например: Diacon N, Diacon P (Австрия), TruLab N, TruLab P (Германия), «ФилоНорм» или «ФилоПат» (Украина). Если значения контроля выходят за пределы установленного диапазона, проверьте оборудование, реактивы и возможные технические проблемы. Каждая лаборатория должна установить собственную внутреннюю систему контроля качества и корректирующие действия, если контроль не соответствует допустимым нормам.
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аминотрансферазы катализируют образование глутаминовой кислоты из 2-оксиглутарата путем
переноса аминогрупп.
В норме АсАТ присутствует во многих тканях, но наибольшие концентрации определяются в
печени, сердечной мышце, а также в почках и поджелудочной железе.
Уровень сывороточной АсАТ повышается при гепатите и других заболеваниях печени,
сопровождающихся некрозом гепатоцитов: инфекционном мононуклеозе, холестазе, циррозе,
метастатической карциноме печени, белой лихорадке и при назначении различных лекарственных средств, таких как опиаты, салицилаты или ампициллин, после инфаркта миокарда, при тяжелой коронарной недостаточности, после приступов параксизмальной тахикардии, при заболеваниях скелетных мышц (например, прогрессирующая мышечная дистрофия), при остром панкреатите и других заболеваниях.
Поскольку печеночный специфический фермент АлАТ значительно повышен только при
гепатобилиарных заболеваниях, то повышение уровня АсАТ может произойти вследствие повреждения сердечных или скелетных мышц, а также паренхимы печени. Таким образом, применяют параллельное измерение АлАТ и АсАТ, чтобы отличить повреждение печени от повреждения сердечных или скелетных мышц. Соотношение АсАТ/АлАТ используется для дифференциальной диагностики при заболеваниях печени. Хотя соотношение < 1 указывает на легкое поражение печени,
соотношение > 1 связано с тяжелыми, часто хроническими заболеваниями печени.
Клинический диагноз должен устанавливаться на основе интеграции клинических и лабораторных
данных.